6.6.1.1.1/2. aStem®-iNK™-allo-f™ 现货型off-the-shelf诱导多能干细胞iPS分化自然杀伤细胞NK液氮冷冻制剂--->CAR-NK液氮冷冻制剂
立项信息：
泉生公司临床前试验进展
1. 研究背景及现状
近年来，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor , CAR) 修饰的T细胞CAR-T细胞在血液病治疗中取得了显著的效果，为血液肿瘤患者带来了新的希望，已成为最有希望的肿瘤免疫治疗方法之一，成为各大企业研发的热点。但是由于CAR-T细胞疗法会产生细胞因子风暴等不良反应及对实体瘤的治疗效果不佳，使得CAR-T细胞的临床应用仍面临挑战。这些挑战促进了其他的免疫细胞作为CAR修饰的候选细胞，其中包括自然杀伤细胞 (Natural killer cells，NK cells)。
NK细胞是固有免疫细胞，作为第一道防线保护机体免于病原侵袭和恶性化。NK细胞分布于外周各淋巴器官和血液循环系统，约占人外周血淋巴细胞的10%～15%。与T、B细胞不同的是，NK细胞无需抗原的预先刺激与活化即可直接杀伤被病毒感染的细胞或者肿瘤细胞[1]。
NK细胞可以通过多种机制介导细胞毒活性，首先，通过NK细胞表面的FcγRⅢ（CD16）与抗体Fc段结合，介导ADCC效应。NK细胞还可以通过表达FasL和TRAIL等诱导靶细胞凋亡，而激活的NK细胞可通过产生IFN-γ 进一步激活DC和巨噬细胞，对适应性免疫应答具有协同增效作用。当NK细胞与靶细胞形成免疫突触时，会释放预先形成的含有穿孔素和颗粒酶的溶细胞颗粒，导致靶细胞裂解[2, 3]。NK细胞以MHC非依赖的方式识别抗原，引起较弱的移植物抗宿主反应和细胞因子风暴等不良反应[4]。
目前绝大多数临床用NK细胞或临床前研究用NK细胞来源于人外周血单核细胞（PBMC）[5]、脐血（UCB）、细胞株(系)、人胚胎干细胞（hESC）及诱导多能干细胞（iPSC）[6]。由于NK细胞只占外周血淋巴细胞含量的约10%和脐血含量20%，因而限制了其多次回输。因此，人们尝试用多种技术来扩增NK细胞，如采用多种细胞因子体外扩增外周血分离的NK细胞，使用NK细胞株（系）和将造血干细胞分化为NK细胞等[7, 8]。常用的实验性造血干细胞主要有人外周血来源造血干细胞、人脐带血造血干细胞、人胚胎干细胞/诱导多能干细胞来源造血干细胞等几种类型[9]，但是由于由前两种造血干细胞诱导分化来的NK细胞虽然具有无限的复制潜能，但功能尚未成熟，核型也未可知。因此，研究与NK细胞相关疾病时，如何获得足够数量的具有免疫活性的NK细胞成为整个实验的基本条件。
iPSC是体细胞被重新编程为胚胎样细胞状态细胞，其具备高扩增能力，可以从一个供体的少量体细胞样本中大量制备，同时iPSC具有多能性，可以将它们分化为任何所需的细胞类型，包括自然杀伤(NK)细胞[10]。与需要胚胎捐赠者的ESC不同，iPSC有更广泛的捐赠者群体，这简化了捐赠者与患者的匹配。当作为主细胞库储存时，由单个iPSC克隆分化诱导的体细胞为临床应用提供了强大且可重复的细胞来源[11]。
使用包括iPS-NK在内的iPSC的临床试验已被大量开展，用于治疗多种疾病[12]。第一次使用iPSC产品治疗的病例是年龄相关性黄斑变性的住院试验，自体成纤维细胞被重编程为iPSC，然后分化为视网膜上皮细胞片并移植到患者的眼睛中[13]，得到了可喜的结果。
限制iPSC分化来源的细胞在临床上应用的主要原因是难以规模化生产。iPS-NK分化协议可分为二维和三维（2D和3D）培养系统。这两种方法都诱导造血分化并通过造血祖细胞(HPC)阶段以获得NK细胞。而2D培养系统显然难以规模化和标准化。iPSC在没有饲养层（低附着板）的情况下悬浮培养时，它们会自发地形成称为胚状体(EB)的聚集体。EB中的细胞响应外源性细胞因子生长并分化为特定的细胞谱系。然而，EB的一个问题是它们的大小不一，这会影响分化的可重复性，从而难以满足良好生产规范(GMP)。Spin-EB是解决此问题的一种方法。对已知数量的iPSC进行离心会产生大小均匀的EB，从而实现同步和更有效的分化。Kauffman等应用自旋EB在无饲养层条件下生成iPS-NK，无需细胞分选，这种方法可以应用于适合临床应用的完全定义的系统[14]。
CAR与NK细胞兼容，近20项使用CAR-NK的临床试验正在进行中，其中一项使用CAR-iPS-NK[15, 16]。致力于开发细胞免疫疗法的Fate Therapeutics于2019年宣布美国FDA已经批准了其在研疗法FT596的研究性新药(IND)申请。FT596源自iPSC细胞系，是该公司首个现成的CAR-NK细胞免疫疗法，靶向多种肿瘤相关抗原。除了以CAR依赖的方式杀死肿瘤靶细胞外，CAR-NK细胞还可以以不依赖于CAR的方式清除癌细胞。CAR-NK细胞仍然具有对肿瘤细胞的天然细胞毒活性[17]，并且可以通过CAR非依赖性机制激活，例如NCRs、NKG2D、共刺激受体DNAM-1 (CD226)和某些激活KIRs (KIR2DS1, KIR2DS4 和 KIR2DL4）[18, 19]。
随着基于CAR和iPSC疗法在临床上的日益成功，人们对将这些技术转向使用NK细胞的新型癌症免疫疗法寄予厚望。与T细胞和更多种类的供体相比，NK细胞提供了一种可能更安全但同样有效的疗法。随着分化方案的改进，iPS-NK的所有表型将与PB-NK相同，包括受体表达和相应的扩增、持久性和对肿瘤环境的反应的细胞毒性，此外，iPSC中基因工程的相对简单性将使CAR-iPS-NK的生产具有所需的特征，例如更高的持久性、目标特异性、甚至能够激活其他免疫细胞以增强对肿瘤的攻击[20]。最后，iPSC库的开发将加快iPS-NK对更广泛人群的可用性，将提供同质产品。
2. CAR-NK细胞的来源（表1）
1) 数据统计显示使用NK92 cell 开展临床最多，但由于回输前需要做灭活处理，临床前及临床效果较差，远不如其他两种来源的NK细胞
2) 自身来源的NK细胞，分类和培养成本高昂，逐渐被放弃
3) 脐带血来源的NK细胞免疫原性低，活性较高，和正常NK细胞功能一致，但转染效率较低，脐带血来源有限
4) iPS-CAR-NK来源不受限，易于进行CAR修饰，是目前比较关注的新方向。
表1. 临床上CAR-NK细胞来源
3. CAR-NK临床试验及市场
目前共有17项CAR-NK的临床试验正在进行中。从临床阶段的角度，绝大多数CAR-NK细胞疗法正处于临床Ⅰ期，占比约68%，处于Ⅱ期的项目约32%，尚无CAR-NK细胞疗法进入临床Ⅲ期。放眼全球，Fate Therapeutics、NantKwest、Nkarta等公司深耕于CAR-NK领域，聚焦国内，阿思科力、科济药业、博生吉、原启生物、星奕昂等企业亦你追我赶。
表2. CAR-NK临床试验
Fate Therapeutics是一家致力于开发程序性细胞免疫疗法的生物制药公司，拥有多款CAR-NK候选产品，包括FT500、FT516、FT596、FT538等。公司专利的iPSC平台不但可生产具有无限扩增及分化潜力的CAR-NK细胞，而且有望大幅降低NK细胞的生产成本。公司的一项生产周期为44天、规模300剂（FT500）的GMP生产数据显示，每剂CAR-NK的成本约3000美元，出厂价为2-3万美元，较CAR-T细胞疗法近40万美元的费用大幅降低。
表3. Fate Therapeutics产品
Nkarta于2020年7月登陆纳斯达克，专注于“通用型”CAR-NK细胞疗法的研发。公司拥有两款核心候选产品，分别是NKX101和NKX109。NKX101是一款靶向NKG2D的CAR-NK产品，由源自健康供体外周血的NK细胞、IL15和靶向肿瘤细胞尚NKG2D配体的嵌合抗原受体工程改造而成。与非工程NK细胞相比，NKX101在临床前模型中识别和杀死肿瘤细胞的能力得以显著提升。
NantKwest致力于利用先天免疫系统中的NK细胞治疗癌症和病毒感染性传染病，公司的免疫肿瘤NK平台具有多种模式诱导和杀灭潜在肿瘤或感染的细胞，包括aNK、haNK、taNK和t-haNK。aNK全称激活性自然杀伤细胞（Activated Natural Killer Cell），特点是不表达抑制性受体（KIRs），避免肿瘤细胞利用KIRs实现逃逸；但由于保留了激活性受体（KARs），因此具有快速定位，识别和杀伤靶细胞能力强等特点。
星奕昂生物科技有限公司专注于免疫细胞药物的研发和产业化, 通过自主创新研发和全球领先公司机构的合作引进相结合，开发iPSC-CAR-NK通用型现货免疫细胞产品，致力于为全球肿瘤患者提供有效的治疗药物。今年7月份，星奕昂生物科技有限公司（Neukio Biotherapeutics）宣布完成了4000万美元的天使轮融资。本轮投资由礼来亚洲基金领投，跟投方包括IDG资本和夏尔巴投资，资金将主要用于研发设施建设和通用型现货免疫细胞技术平台和产品的早期开发。
4. 泉生公司工作 —— 临床级off-the-shelf现货型hiPS源CAR-NK细胞构建
4.1. 泉生方案
Stage 1: Generation of iPSC engineered with multiple modification to enhance iNK functions and persistence
Stage 2: Routine cGMP production of Car-NK consists of 3 stages
4.2. 泉生步骤：
（1）泉生CAR修饰iPS构建
1) hiPS培养；
2) 构建并扩增hnCD16慢病毒；
hnCD16质粒构建
慢病毒的包装
慢病毒扩增并浓缩
3) hnCD16慢病毒感染iPS；
4) 单细胞筛选；
5) 克隆形成扩增；
获得稳定表达hnCD16 iPS系
（2）泉生Spin EBs形成
1) 细胞汇合至70%-80%左右，传代；
2) TrypLE消化5min，加入5ml培养基(DMEM/F12 + 10%FBS)终止消化，并过70um滤膜去除聚集物；
3) 用1ml APEL重悬细胞，并加入10um Y27632，计数，密度为80,000 cells/ml；
4) 将100 μl细胞悬液加入至96孔板，37°C, 5% CO2培养6天。
6天后大约产生50%CD34+造血细胞
（3）泉生spin EBs向iCAR-NK分化
1) 2%明胶预处理6孔板；
2) 用1mlNK cell differentiation medium重悬14-16个EB，加入到1个6孔板的孔，并补充培养基至4ml，1个96孔板传至1个六孔板；
3) 每5-7天换一次培液，一周后NK cell differentiation medium去除IL-3；
4) 继续培养3-4周，每隔7天流式检测NK cell makers (CD45+CD56+)表达；
5) 当大于80%的悬浮细胞为CD45+CD56+时，过70um滤膜。
（4）泉生iCAR-NK成熟及扩增
利用人工抗原提呈细胞(aAPCs)扩增iCAR-NK
1) 使用表达IL-21(mbIL-21) K562细胞作为aAPCs刺激NK细胞增殖。共培养前，将aAPCs辐射灭活；
2) 将NK细胞转移至NK cell expansion medium，密度为300000 cells/ml，并以1：1比例加入aAPCs。
3) 每3-4天换一次培液，并补充50 U/mL IL2;
4) 该体系可扩增至少3个月。
（5） 泉生iCAR-NK鉴定
1) 通过流式细胞术检测iCRA-NK受体的表达：CD56, CD16, CD94， NKG2D、NKp44、NKp46、KIR、FasL、TRAIL；
2) 与肿瘤靶细胞共培养，检测肿瘤细胞凋亡。
（6） 泉生iCAR-NK冻存运输
4.2. 泉生临床前试验进展
4.2.1. 泉生iPS扩增培养体系
依托现有的商品化试剂，通过极为成熟的培养方法，团队成员充分掌握了iPS快速扩增实验方法。细胞可实现指数级扩增，单位iPS经过15天培养可实现200万倍以上扩增（图1）
图1. 单位iPS扩增曲线（泉生临床前试验数据；商业秘密）
扩增的iPS维持稳定的多能干细胞特异标志，如高水平表达碱性磷酸酶（图2）、表达OCT4、NANOG、SOX2和LIN28A基因（图3）、高水平表达NANOG和OCT4蛋白标志（图4）。
图2. iPS碱性磷酸酶染色（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图3. RT-PCR检测iPS细胞表达OCT4、NANOG、SOX2和LIN28A基因（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图4. 细胞免疫荧光检测iPS表达NANOG和OCT4蛋白（泉生临床前试验数据；商业秘密）
同时，扩增的iPS保持较高的细胞纯度。通过流式细胞术检测显示iPS细胞纯度高达99.8%（图5）。图5流式细胞术检测iPS多能性标志物OCT4的表达率。
图5. 流式细胞术检测iPS多能性标志物OCT4的表达率（泉生临床前试验数据；商业秘密）
4.2.2. 泉生iPS多向分化潜能
经验证，扩增的iPS保持良好的分化潜能，通过添加特定的培养基，可诱导iPS分化为搏动的心肌细胞（CM）（图6）。RT-PCR检测iPS分化的细胞表达心肌细胞特异性结构蛋白TNNT2和TNNI3，心房样心肌细胞特异性结构蛋白MYL7，心室样心肌细胞特异性结构蛋白MYL2（图7）。细胞免疫荧光鉴定iPS分化的细胞表达心肌特异性结构蛋白cTNT和ɑ actinin（图8）。此外，iPS分化的心肌细胞纯度高达96.79%（图9）。
图6. iPS分化为心肌细胞流程图
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图7. RT-PCR检测iPS-CM功能性基因的表达（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图8. 细胞免疫荧光检测iPS分化的心肌细胞特异蛋白的表达（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图9. 流式细胞术检测hiPS-CM分化效率（泉生临床前试验数据；商业秘密）
通过添加特定的培养基，可诱导iPS分化为肝细胞（HLC），iPS来源的iPS-HLC呈现鹅卵石状排列，细胞形态饱满，连接紧密（图10）。RT-PCR检测iPS分化的细胞表达肝细胞特异基因AFP、ALB、A1AT、HNF4A、CYP3A4，其中AFP表达量较低，其他成熟标志基因表达量高，说明肝细胞达到成熟状态（图11）。细胞免疫荧光鉴定iPS分化的细胞表达肝细胞特异性结构蛋白Albumin和α-1 Antitrypsin蛋白（图12）。同时，iPS分化的肝细胞具有较强的糖原储存能力（图13）以及肝功能（图14）。
图10. iPS源肝细胞形态图（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图11. RT-PCR检测iPS- HLC功能性基因的表达（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图12. 细胞免疫荧光检测iPS分化的肝细胞特异蛋白的表达（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图13. PAS检测iPS- HLC糖原储存（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图14. 吲哚菁绿检测iPS- HLC肝细胞功能（泉生临床前试验数据；商业秘密）
4.2.3. iPS定向分化自然杀伤细胞（NK）
依托现有技术，结合相关文献，采用分阶段法诱导iPS分化制备NK细胞。第一阶段诱导iPS形成EB，进行悬浮培养，第二阶段对EB进行贴壁培养，实现iPS-NK细胞制备（图15）。
图15. iPS定向分化NK示意图
现阶段已对不同密度iPS细胞诱导形成EB展开实验，分别对500、1000、1500、2000、3000和4000个iPS细胞形成EB大小进行对比（图16）。
图16. 不同iPS细胞密度形成EB大小（d6）（泉生临床前试验数据；商业秘密）
现正处于推进筛选的合适的iPS形成的EB实施贴壁培养阶段。
未来将结合先进的多能干细胞悬浮培养体系，进行生物反应器悬浮培养快速扩增iPS[21, 22]（图17），进一步标准化制备大小合适的EB（图18），实现流程化、标准化、规模化生产制备EB，从而大规模生产iPS源NK细胞。
图17. 悬浮培养罐[21]（泉生临床前试验数据；商业秘密）
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图18. 悬浮培养的大小一致的细胞团[21]（泉生临床前试验数据；商业秘密）
2.4 CAR-NK安全性评价
现已建立iPS源心肌细胞的体外安全性评价体系，可用于肿瘤药物及新型疗法的安全性评价。
以传统抗癌化疗药物阿霉素（doxorubicin, DOX）为例，证明了DOX可引起心肌细胞的损伤及死亡，具有一定心肌毒性(图19)。
图19. DOX体外诱导的心肌损伤及死亡
DOX剂量依赖性诱导iPS源心肌细胞的死亡。DOX处理后，部分心肌细胞死亡漂浮，证明DOX具有一定心肌毒性（图20）。
图20. DOX诱导iPS源心肌细胞死亡（泉生临床前试验数据；商业秘密）
DOX剂量依赖性诱导iPS源心肌细胞LDH释放水平的增高（图21）。LDH为乳酸脱氢酶，在临床上作为心肌损伤的标志物之一。
图21. DOX诱导iPS源心肌细胞LDH释放水平增高（泉生临床前试验数据；商业秘密）
临床数据显示，CAR-T细胞治疗副作用包括心脏毒性不可忽视，包括各种心律失常、短暂性左心室功能不全和肌钙蛋白升高，这些都会导致更严重的后果，如心源性休克、猝死等[23, 24]。CAR-NK细胞较T细胞有明显的优势，免疫原性更低。目前建立的iPS源心肌细胞和肝细胞模型为CAR-NK安全性评价提供有效体外评价模型。
3. 时间计划：
表4. 时间计划
项目内容 | 时间 | 备注 |
CAR设计 | 2021.09- | |
慢病毒构建扩增 | 2021.10-2022.03 | |
修饰hiPS构建 | 2021.12-2022.08 | |
SpinEB分化体系摸索 | 2021.06-2021.12 | |
Spin EB向iNK分化体系摸索 | 2021.09-2022.05 | |
iNK扩增 | 2022.05-2022.10 | |
iNK鉴定 | 2022.10-2023.01 | |
iNK冻存运输条件摸索 | 2022.01-2023.06 |
参考文献
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