脊髓损伤（spinal cord injuries, SCI）是一种毁灭性的创伤，会导致长期残疾。SCI通常是由各种意外引起的颈椎或胸椎区域的脊柱脱位或骨折引起的(Khazaei, Siddiqui et al. 2015)。可导致急性水肿或出血性挫伤，并导致损伤水平以下的运动、感觉和自主神经功能障碍(Sekhon and Fehlings 2001)。SCI带来了沉重的公共卫生负担(Guo, Feng et al. 2021)。据不完全统计，我国SCI患者已超过100万，而且还在以每年12万的速度增长(Reinhardt, Zheng et al. 2017, Yuan, Shi et al. 2018)。SCI可通过手术、糖皮质激素或细胞疗法进行治疗，随后是一段康复期，而SCI的经济负担（表1）除了康复治疗与服务外，还包括昂贵的个人援助、因残疾和社会孤立造成的生产力损失,这些治疗给患者及其家人带来沉重的经济负担，每位患者一生的直接费用从1.1～470万美元不等(Zhou, Lou et al. 2021)，同时对我国经济造成了较大影响。

表1 2013-2018年急性创伤性SCI患者费用趋势(Zhou, Lou et al. 2021)

1.2.我国创伤性SCI流行病学、治疗现状和经济负担

1.2.1.SCI定义与病因

脊髓是运动和感觉信息在大脑和身体之间传递的主要通道。脊髓包含围绕中央区域（灰质）的纵向定向的脊髓束（白质），大多数脊髓神经元细胞体位于该区域。灰质被分为包括感觉神经元和运动神经元的部分。来自脊髓感觉神经元的轴突通过节段神经或神经根进入脊髓，来自运动神经元的轴突离开脊髓(Rupp, Biering-Sørensen et al. 2021)。

SCI被定义为暂时或永久导致其功能改变的脊髓损伤，当外部物理冲击（如跌倒、机动车辆损伤或运动相关损伤）严重损伤脊髓时，就会发生创伤性SCI(Zhou, Lou et al. 2021)。脊髓在受伤后可导致与神经元和神经胶质细胞死亡相关的组织快速坏死——即在SCI后数秒至数分钟内发生原发性（急性）损伤。血-脊髓屏障破坏和随后形成自由基和氧化应激后的继发性损伤导致更多的神经元和神经胶质死亡。其他后果包括髓鞘解体和脱髓鞘。由血液中免疫细胞浸润引起的星形胶质细胞活化，导致反应性神经胶质增生和随后由细胞外基质、神经胶质和纤维化细胞组成的神经胶质瘢痕形成。硫酸软骨素和其他蛋白质的分泌抑制轴突再生并阻止脊髓功能恢复。此外，组织体积的减少可能导致微囊的形成，随后这些微囊合并在一起形成缺乏细胞迁移和生长所需的细胞外基质的大病灶(Csobonyeiova, Polak et al. 2019)。SCI是一种严重的神经系统疾病，会影响感觉和运动信号跨病变部位以及自主神经系统的传导。患者会出现多种症状，包括肢体无力、感觉障碍和躯干不稳定，以及各种自主神经异常，这些症状可归因于受损的神经纤维束(Masood, Farzana et al. 2020)。

1.2.2.SCI流行病学

一项最新的研究调查了2013年1月至2018年12月，从全国11个省市的37家医院共招募的14754例患者，通过分析流行病学和临床特征(Zhou, Lou et al. 2021)。结果显示，男性SCI患者占75.3%（n=11115）。总体平均年龄为50.0岁，男性为49.2岁，女性为52.2岁。按职业考虑SCI，患者更有可能是农民（n=5568，占37.7%）。SCI的前三大病因，占所有病因的83.9%，分别是：低位跌落（n=4452，30.2%）、高位跌落（n=4398，29.8%）和交通事故（n=3524，23.9%）。SCI最常见于颈段（n=8944，60.6%），最常表现为不完全四肢瘫痪（n=6483，43.9%）。几乎一半的患者（n=7168名，48.6%）在入院时被归类为AISD级，其次是AIS级（3671名，24.9%）和AISC级（2512名，占17.0%）（表2）。

表2中国2013-2018年创伤性SCI患者的流行病学和临床特征(Zhou, Lou et al. 2021)

1.2.3.SCI常规治疗

目前SCI的治疗方案主要集中在稳定脊柱、防止继发性损伤的进展和控制炎症(Khazaei, Ahuja et al. 2017)。常见的治疗手段包括外科手术、糖皮质激素治疗、神经营养药物、脱水剂和泻药治疗等。

（1）外科手术

10918名（74.0%）患者在SCI后接受了手术。在15～24岁的患者中发生手术率最高（n=591，占768人的77.0%）。对于病因组，高位跌倒患者更可能接受手术（n=3571，占4398人的81.2%）。考虑到损伤程度，马尾患者的手术率最高（n=27，占29的93.1%）。完全性截瘫患者（n=2343，占2919人的80.3%）和AISB级（n=825，占1009人的81.8%）分别考虑到损伤严重程度和AIS等级，手术率最高。在有准确手术时间的10882名患者中，少数（n=324，占10882名的3.0%）在24小时内接受了手术。此外，大约四分之一（n=2698，占10882名的24.8%）的患者4.0天内接受了手术，其次是大约一半（n=5462，占10882名的49.9%）的患者在4.0～11.9天内接受手术，以及大约四分之一（n=2758，10882的25.3%）的患者受伤后超过11.9天接受手术（表3）。

表3 SCI患者的治疗方法和手术时机(Zhou, Lou et al. 2021)

（2）糖皮质激素治疗

2084名患者（14.1%）接受了高剂量（≥500mg）的MPSS/MP治疗，其中641名患者（占2084人的30.8%）在SCI后8小时内接受了治疗，其次是1443名（占2084人的69.2%）在超过8小时后接受治疗。超过三分之一（n=5352，占14754人的36.3%）的患者接受正常剂量的MPSS/MP（<500mg），其中大多数患者（n=5012，5352人中的93.6%）持续接受MPSS/MP治疗，少数患者（n=340，5352的6.4%）间歇性地接受MPSS/MP治疗（表4）。

表4 SCI患者接受MPSS/MP治疗剂量与时机表(Zhou, Lou et al. 2021)

（3）神经营养药物、脱水剂和泻药治疗

约三分之二（n=9590，14754例的65.0%）患者接受了神经营养药物治疗，前三类为GM-1神经节苷脂（n=4979，51.9%）、小鼠神经生长因子（n=2785，29.0%）和甲钴胺(n=2580,26.9%)。在使用脱水剂的病例中（n=8898，14754例的60.3%）甘露醇（n=7558，84.9%）是最常用的。甘油或甘油灌肠剂(n=1434,95.1%)在使用泻药的病例中所占比例最高(n=1508,10.2%)（表5）。

表5创伤性SCI患者住院期间神经营养药物、脱水剂和泻剂的使用情况(Zhou, Lou et al. 2021)

1.2.4.SCI经济负担和住院时间

10945例急性创伤性SCI病例的治疗平均总费用为7.1万元人民币，单日费用为0.44万。总费用和每日费用都随着患者年龄的增长而逐渐下降。考虑到职业类别，学生的总费用最高（7.96万），但工人的每日费用最高（0.44万）。考虑到病因组，被坠落物体击中的患者的总费用最高（9.59万），而高位跌落的每日费用最高（0.49万）。考虑到损伤程度，马尾的总费用和每日费用最高（9.41万；0.51万）。随着AIS等级（E到A）的增加，总费用和每日费用都增加了。平均住院时间为19.9天(SD=26.2)(Zhou, Lou et al. 2021)。

1.3.SCI的AIS分类与恢复

根据美国脊髓损伤协会（AIS）神经学分类的国际标准，脊髓损伤分为完全性和不完全性。完全性损伤定义为AIS A，不完全损伤包括AIS B、AIS C、AIS D和AIS E。

AIS	功能描述
A（完全没感觉）	在骶骨节段S4-S5中没有保留任何感觉或运动功能。
B（感觉不完整）	感觉功能而非运动功能在神经平面以下保留，包括骶骨节段S4-S5。
C（运动功能不全）	在自主肛门收缩时，在最尾部骶骨节段保留了运动功能，或者患者符合感觉不完整状态的标准（通过LT、PP或DAP在最尾部骶骨节段[S4-S5]保留了感觉功能），并且在身体两侧的同侧运动水平以下三个水平以上的运动功能有所保留。神经水平以下的关键肌肉中有一半以上的肌肉等级低于3。
D（运动功能不全）	神经平面以下保留运动功能，神经平面以下关键肌肉至少有一半的肌肉等级为3级或以上。
E（正常）	所有运动和感觉功能完全恢复，但仍可能有异常反射。

表6美国脊髓损伤协会评分标准(Rupp, Biering-Sørensen et al. 2021)

目前，手术是主要的治疗方法（包括减压内固定或融合术），特别是对于完全性损伤，因为它可以防止进一步的损伤并改善脊髓状况(Yuan, Shi et al. 2018)。尽管如此，对于完全性截瘫患者，损伤程度起重要作用，运动恢复总体上是有限的（表7）。腰椎损伤对LEMS恢复的预后最好，其次是中下胸损伤，高胸损伤（T2-T6）的预后最差。大约30%的颈椎水平损伤最初分类（在受伤后30天内）为AIS A患者恢复为感觉不完全状态，大约一半患者改善为AIS B，另一半为运动不完全状态。四肢瘫痪患者从神经系统完全性损伤到不完全性损伤的转化率高于截瘫患者。在AIS A四肢瘫痪的患者中，约65%的人将恢复至少1个运动水平（20%～30%的人为2个或更多运动水平），而约5%的患者会恶化1～3个运动水平，最多30%的人不会发生变化。AIS B四肢瘫痪患者的运动恢复报告存在很大差异，但一年后的总体恢复率高于初始AIS A损伤患者(Yuan, Shi et al. 2018)。由于目前常规疗法可能无法完全治愈SCI，患者可能会在轮椅上度过余生，大约16%的患者（患有完全性四肢瘫痪的患者）面临颈部以下终身完全瘫痪的未来。此外，全世界数百万患者中的多数人也在遭受失禁、慢性疼痛和精神障碍(Watson and Yeung 2011)。

表7一年内AIS A患者的平均下肢运动得分改善(Yuan, Shi et al. 2018)

2. 细胞疗法与SCI

在过去的十年中，许多研究表明SCI早期治疗后可显着恢复；然而，仍然有大量的患者由于缺乏有效及时的治疗或损伤程度较重而未能达到预期的治疗效果。目前，对于神经再生策略的重点是通过刺激内源性修复过程或细胞移植来替换受损细胞和轴突。而细胞移植治疗被认为是替换受损细胞和促进神经保护和修复最有前途的治疗手段。细胞疗法通过诱导恢复髓鞘再生和轴突生长的合适条件，随后与新神经元重新连接，提供了更新脊髓功能的可能性(Nakamura and Okano 2013)。

SCI细胞治疗靶向的神经修复机制包括轴突再生和髓鞘再生、神经可塑性、神经保护、神经调节、神经结构修复、炎症和免疫反应的调节、神经发生、血管生成、疤痕和空洞形成的减少以及细胞替代(Huang, Young et al. 2020)。为数不多的急性或亚急性SCI细胞疗法临床试验显示了积极的结果(Guo, Zahir et al. 2012)。细胞移植是中慢性SCI患者的重要治疗方法。已经有研究证实了多种细胞类型的髓鞘再生能力，包括胚胎干细胞(ES)、成体神经干/祖细胞(NSC/NPC)、嗅鞘细胞、少突胶质祖细胞(OPC)、雪旺氏细胞和骨髓基质细胞(Csobonyeiova, Polak et al. 2019)。通过血管内输注、鞘内或病灶内注射或多通道给药将细胞移植到脊髓实质中可以改善神经功能和生活质量，大多数受试者的感觉和运动功能均恢复(Iwatsuki, Tajima et al. 2016, Guo, Feng et al. 2021)。

3. OPC细胞与移植治疗机理

OPC是成人中枢神经系统中增殖能力最强和最分散的祖细胞群，这使得这些细胞能够对损伤做出快速反应。外伤性SCI后少突胶质细胞和髓鞘丢失，影响信号有效传导，并可能影响轴突的长期健康。作为回应，OPC增殖，然后分化为新的少突胶质细胞和雪旺氏细胞，使轴突再髓鞘化。这在实验性SCI后的高效髓鞘再生达到高潮，其中几乎所有完整的脱髓鞘轴突在啮齿动物模型中都进行了髓鞘再生(Duncan, Manesh et al. 2019)。然而，持续的传导功能障碍表明SCI后自发内源性髓鞘再生不足(Nashmi and Fehlings 2001)，导致内源性细胞中替换少突胶质细胞是不完整的或太慢而不能完全有效。因此，髓鞘形成细胞移植使脱髓鞘剩余轴突再生髓鞘可能是治疗脊髓损伤的一种有效的治疗策略。OPC细胞移植是一种非常适合治疗SCI的候选疗法。

使用OPC移植治疗SCI的关键前提之一是脱髓鞘作为脊髓损伤发病机制的主要因素。为了使髓鞘再生疗法取得成功，必须有适当的靶点（裸露的、完整的轴突）治疗后功能在一定程度上恢复。OPC移植是一种双重策略，不仅旨在实现髓鞘再生，而且还提供营养支持和修复环境(Keirstead, Nistor et al. 2005)。脊髓损伤启动了多种修复机制，包括内源性髓鞘再生和许多神经营养因子的表达增加，例如转化生长因子-β2(TGF-β2)和脑源性神经营养因子(BDNF)(Bareyre and Schwab 2003)，这种上调被认为有助于神经保护甚至轴突萌芽。然而，轴突萌芽和内源性修复通常会失败，部分原因是修复环境不足，无法克服抑制机制或促进维持再生(Hagg and Oudega 2006)。此外，虽然内源性髓鞘再生经常在SCI后出现，但它通常在功能和解剖学上是不完整的(Mcdonald and Belegu 2006, Barnabé-Heider, G?Ritz et al. 2010)。因此，希望在受伤后不久移植大量OPC将创造一个“修复环境”，并允许这些过程进一步发展。

研究发现，OPC能够产生大量的神经营养因子，包括肝细胞生长因子、激活素 A、TGF-β2和BDNF等，有助于修复脊髓环境(Barnabé-Heider, G?Ritz et al. 2010)，在体外甚至能促进大鼠感觉神经元的轴突生长(Zhang, Denham et al. 2006)。体内研究也表明OPC移植可以显着改变病变的发病机制并影响基因表达，使其朝着未受损伤的模式发展(Zhang, Denham et al. 2006)。仅暴露于由OPCs和少突胶质细胞调节的培养基就足以增加神经元的存活率和轴突延长(Wilkins, Majed et al. 2003)。因此，即使在没有髓鞘再生的情况下，OPC移植也有可能通过提供营养支持和创造再生环境，防止继发性损伤阶段出现的细胞损伤和细胞凋亡，从而带来临床改善(Watson and Yeung 2011)。

4. hESCs分化OPC细胞

人类胚胎干细胞(hESCs)具有两个独特的特性：无限的自我更新和向任何体细胞类型分化的能力，包括心肌细胞、OPC、肝细胞和NK细胞等。在过去的二十年里，hESC直接分化为靶向细胞谱系取得了很大进展。

大量研究报道了hESCs分化为神经谱系，最终产生了hESCs衍生的OPCs（表8）。Keirstead等研究表明，SCI损伤后一周，移植的hESCs来源的OPCs能够产生少突胶质细胞，诱导髓鞘再生，增强运动功能(Keirstead, Nistor et al. 2005)。移植后，神经营养因子如脑源性神经营养因子(BDNF)、神经突生长促进因子2(NRF2)、转化生长因子-2(TGF-β2)、肝细胞生长因子(HGF)、和激活素A在hESC衍生的OPCs中表达(Sharp, Frame et al. 2010, Marton, Miura et al. 2019)。2009年，FDA批准了使用hESC衍生的OPC治疗SCI患者的Ⅰ期临床试验。最近，在颈椎脊髓损伤模型中，hESCs有效分化为OPC，其结果支持了在美国启动感觉运动完全性颈椎脊髓损伤患者的I/IIa期临床试验(Manley, Priest et al. 2017)。Erceg和同事证实，hESCs衍生的OPCs和MPs增强了脊髓横断后的运动恢复(Erceg, Laínez et al. 2008)。尽管移植的hESCs源性神经祖细胞的定位、增殖和神经发生的确切机制尚不清楚，但这些发现表明，hESCs衍生的OPCs可能是一种有前景的治疗脊髓损伤的方法。

表8不同的方案诱导hESCs分化OPC

5. OPC细胞人体临床实验进展与相关公司信息

Lineagecell公司的一项被列为已完成的试验是1/2a期剂量递增研究，研究立体定向注射hESCs衍生的OPC。该研究评估了受伤后21～42天的AIS A或B型颈脊髓损伤患者。患者分别接受1次200万或1000万个细胞注射，或2次1000万个细胞注射，总共2000万个细胞。评估的主要结果是注射后一年内发生的不良事件数量。迄今为止，没有发生重大的不良事件。临床试验前的动物试验表明，在脊髓损伤后7天移植hESCs衍生的OPC后，髓鞘再生和运动功能恢复有显着改善。尽管尚未在同行评议的文献中发表，赞助行业的公开声明报告称，三分之二的患者有显着改善。早期的1期试验结果为阳性，其中5名AIS A胸部损伤患者在受伤后7～14天内接受了立体定向移植，没有发生手术并发症，也没有严重的不良事件(Platt, David et al. 2020)。迄今为止，该公司的OPC1产品已在两项临床试验中进行了测试；5名患者的1期安全性试验和25名患者的1/2a期剂量递增试验（“SCiStar试验”）。OPC1的临床开发部分由加州再生医学研究所提供的1430万美元资助。2019年1月，SciStar试验公布了顶线数据：改善运动功能（至少一级：96%），（两级或更多：32%）；细胞移植成功率达到96%；积极的安全性——迄今为止，没有与OPC1细胞相关的严重不良事件(SAE)（包括对1期安全性研究对象的长期随访）（图1）。

图1 OPC1移植临床实验结果。

6.泉生公司工作—aStem®-ESC-OPC™-allo-f™现货型off-the-shelf胚胎干细胞ES株生物反应器悬浮培养分化制备异体少突胶质前体细胞制剂

6.1.泉生方案

Stage 1: 生物反应器规模化悬浮培养

Stage 2: 常规细胞工厂贴壁培养扩增。

6.2.泉生生产制备工艺步骤：

6.2.1.hESC细胞复苏、传代培养与冻存

6.2.1.1.试剂及培养皿准备

mTeSR1培养基：mTeSR1 Basel medium （stemcell；05851）及5 × supplement （stemcell；05852）4 °C溶解后，按4：1混匀，配成完全培养基。

50 mM Y27632储存液：向10mg Y27632（selleck；S1049）粉末加入624.5 μL DMSO（sigma；D8418）溶液，混匀后分装至EP管中，-80 °C可保存6个月，-20 °C可保存1个月。

mTeSR1（10 μM Y27632）培养基：50 mLmTeSR1恢复至室温后加入10 μL Y27632储存液，混匀备用。

培养皿的准备：将35mm培养皿、15mL离心管及DMEM培养基（gibco；11965092）置于冰上预冷，Matrigel（corning；354277）置于冰上溶解。用预冷的DMEM稀释Matrigel 100倍，混匀。按2 mL/皿的量包被35mm培养皿，37 ℃静置30 min后备用。

6.2.1.2.细胞复苏培养

取出一支新的15 mL离心管，加入4 mL恢复至室温的mTeSR1（10 μM Y27632）培养基；

快速从液氮罐中取出含有hiPSC/hESC的冻存管，立刻置于37 ℃水浴中，迅速摇动冻存管直至mFreSR完全融化，冻存管用酒精棉球擦拭表面后置于超净工作台内，防止污染；

将细胞悬液转移至15mL离心管中，并置于37 ℃水浴3 min，之后再加入2 mL mTeSR1（10 μM Y27632）培养基；

重复上述步骤2次；

200g离心5 min，弃上清，加入2 mL mTeSR1（10 μM Y27632）培养基，重悬细胞，轻柔吹吸2次混匀，计数备用；

取出包被过Matrigel的培养皿，吸去包被液，并将细胞悬液按2 × 10⁵细胞/mL的密度接种到准备好的培养皿中，水平十字摇匀。

5% CO₂的37 ℃恒温细胞培养箱中培养，24h后更换新鲜的mTeSR1培养基。

6.2.1.3.细胞传代培养

当满足以下条件之一时需要进行传代：细胞汇合度达到80%以上；细胞集落过大，中央细胞生长不良；细胞集落边缘有开始分化的迹象。

1) 将mTeSR1完全培养液取出并平衡至室温，取出包被过Matrigel的培养皿，吸去包被液备用；

2) 吸走待传代细胞培养皿中的培养基，并且加入无钙镁的PBS溶液洗一次；

3) 每皿加入0.5mL Accutase（stemcell；07920）酶，37 ℃孵育2-3 min，显微镜下观察到细胞解离成单细胞；

4) 每皿加入0.5mL mTeSR1（10μM Y27632）培养液终止消化，并小心吹打，使细胞脱离；

5) 转移细胞悬液到15mL离心管中，200g离心5 min；

6) 弃上清，加入新鲜mTeSR1（10μM Y27632）培养液重悬细胞；

7) 按1：6~1：12传代至包被过Matrigel基质胶的培养皿，每皿补充mTeSR1（10μM Y27632）培养液至2mL，水平十字摇匀；

8) 5% CO₂的37℃恒温细胞培养箱中培养，24h后换液培养。直至达到可以传代的标准。

6.2.1.4.细胞冻存

1) 细胞生长至80%左右汇合，且生长状态良好时进行冻存。将mFreSR冻存液（stemcell；05855）4℃融化备用；

2) 吸走待传代细胞培养皿中的培养基，并且加入无钙镁的PBS溶液洗一次；

3) 每皿（35mm）加入0.5mL Accutase酶，37℃孵育5min，显微镜下观察到细胞解离成单细胞；

4) 每皿加入0.5mL mTeSR1完全培养液终止消化，并小心吹打，使细胞脱离。

5) 转移细胞悬液到15mL离心管中，200g离心5min；

6) 弃上清，加入适量mFreSR冻存液重悬细胞，计算后调整细胞浓度为1× 10⁶细胞/mL，按0.5mL一支冻成管转移到冻存管中；

7) 以1℃每分钟的速率降至-80℃过夜（一般常见商品化程序降温盒均可提供此条件）；

8) -80℃过夜后，将冻存细胞转移至液氮保存。

6.2.2.hESC细胞OPC分化

6.2.2.1.试剂准备

hESC生长培养基：80% KO-DMEM（Gibco；10829018）、20% KOSR（Gibco；10828028）、1 mM L-glutamine（Gibco；25030149）、0.1 mM β-mercaptoethanol (Gibco；21985023)、1% nonessential amino acids (Gibco；11140050)、 4 ng/ml bFGF（PeproTech；100-18B）。

GPM培养基：DMEM/F12 （Gibco；11320033）、1× B27 （Gibco；17504044）、25 ug/ml insulin （sigma；I2643）、6.3 ng/ml progesterone （mce；HY-N0437）、10 ug/ml putrescin（sigma；P5780）、50 ng/ml sodium selenite（sigma；S5261）、50ug/ml holotransferin（sigma；616424）、40 ng/ml triiodothyroidin（sigma；未查到）。

6.2.2.2.诱导hESC向OPC分化

hESC经Accutase酶消化为单细胞后，以10⁴细胞/μL的密度在低附着培养皿中使用50% hESC生长培养基、50% GPM、4 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF(Rockland; RK-009-F01-C26)培养基以刺激EB形成；

接种后的第1天，使用50% hESC生长培养基、50% GPM、20 ng/ml EGF和10 μM RA（sigma；R2625）培养基培养；

第2-8天，每天用GPM、20 ng/ml EGF和10 μM RA培养基培养

第9-26天，EB使用GPM、20 ng/ml EGF培养基中培养，每2天更换一次；

第27天，EB接种在预涂有Matrigel的培养皿中，使用GPM、20 ng/ml EGF培养基培养7天，每2天更换一次培养基；

第34天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（gibco；25200056）收集细胞，重新接种到Matrigel包被的培养皿中，并在GPM、20 ng/ml EGF培养基中再培养7天，每2天更换一次培养基；

第41天，用0.25%胰蛋白酶收集细胞，过滤以去除残留的细胞聚集体，离心后使用20% DMSO重悬细胞，并在液氮中冷冻保存。

6.3.泉生临床前试验进展

6.3.1.泉生hESC扩增培养体系

依托现有的商品化试剂，通过极为成熟的培养方法，团队成员充分掌握了hESC快速扩增实验方法。细胞可实现指数级扩增，单位hESC经过15天培养可实现200万倍以上扩增（图1）。

图1. 单位hESC扩增曲线（泉生临床前试验数据；商业秘密）

扩增的hESC维持稳定的多能干细胞特异标志，如高水平表达碱性磷酸酶（图2）、表达OCT4、NANOG、SOX2和LIN28A基因（图3）、高水平表达NANOG和OCT4蛋白标志（图4）。

图2. hES碱性磷酸酶染色（泉生临床前试验数据；商业秘密）

图3. RT-PCR检测hES细胞表达OCT4、NANOG、SOX2和LIN28A基因（泉生临床前试验数据；商业秘密）

图4. 细胞免疫荧光检测hES表达NANOG和OCT4蛋白（泉生临床前试验数据；商业秘密）

同时，扩增的hES保持较高的细胞纯度。通过流式细胞术检测显示hES细胞纯度高达99.8%（图5）。

图5. 流式细胞术检测hES多能性标志物OCT4的表达率（泉生临床前试验数据；商业秘密）

6.3.2.泉生hESC定向分化OPC进展

通过对诱导分化过程中严格添加不同的试剂，经长达41天的不间断培养，各阶段细胞呈现不同的形态（图6）。

图6诱导hES分化为OPC各时间段细胞形态图（4x）。（泉生临床前试验数据；商业秘密）

对诱导分化36天后的细胞进行细胞免疫荧光检测，结果显示细胞表达NESTIN（神经细胞标志蛋白）、NG2（OPC特异标志蛋白）和PDGFR-a（早期OPC特异标志蛋白），初步定义为诱导的细胞为OPC（图7）。

图7细胞免疫荧光检测诱导36d后的细胞表达NESTIN（神经细胞标志蛋白）、NG2（OPC特异标志蛋白）和PDGFR-a（早期OPC特异标志蛋白）。（泉生临床前试验数据；商业秘密）

经冻存后的OPC细胞分别接种于Matrigel growth factor reduced、Gelatin和Laminin 521 LN基质包被的培养皿上，对比了该3中基质对细胞贴壁的作用（图8）。

图8 hESC-OPC冻存后复苏d1细胞贴壁结果（4x）。（泉生临床前试验数据；商业秘密）

生物反应器允许干细胞扩增和分化或不同分化阶段的过程整合，包括悬浮培养和贴壁培养。这种工艺整合将显着提高生物加工的效率，并能够大规模生产具有复杂分化方案的干细胞衍生产品。OPC分化整个实验方案长达有41天，其中包括27天的EB悬浮培养和14天的贴壁细胞培养。搅拌生物反应器可用于EB培养阶段，而基于微载体的生物反应器可用于贴壁培养阶段（图9）。要生产1 × 10¹⁰数量级的OPC，生物反应器中的细胞密度可以达到2-5 × 10⁶个细胞/mL，需要一个1-2L用于EB培养的生物反应器和一个2-4L用于贴壁培养的生物反应器。该工艺整合将显着提高大规模干细胞生物加工的效率。

图9 生物反应器大规模制备hESC-OPC

7.泉生时间计划

项目内容	时间	备注
hES分化OPC培养基体系摸索	2021.09-2021.12
hES分化OPC各阶段质量控制确立	2021.09-2022.06
贴壁培养阶段培养基质对比摸索	2021.11-2022.01
OPC体外扩增条件摸索	2022.01-2022.04
OPC冻存及复苏条件摸索	2022.01-2022.05
OPC冻存运输条件摸索	2022.04-2023.06
生物反应器大规模制备hES-OPC条件摸索	2022.01-2022.12

参考文献：

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