aCGT 双靶点CAR-iNK治疗系统性红斑狼疮
Dual-target CAR-iNK therapy for systemic lupus erythematosust
1. 作用机理 Mechanism of Action
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种严重的影响多器官的自身免疫性疾病，其特点是自身抗体积累、免疫复合物沉积以及免疫耐受失败导致各种靶器官出现炎症性损伤。自身反应性 B 细胞产生大量自身抗体，这些自身抗体反馈形成免疫复合物，从而诱导不断扩大的组织损伤和全身炎症。
B 细胞耗竭疗法已在临床上得到广泛研究，近年的研究表明，通过靶向CD19（B细胞表面抗原）和BCMA（B细胞表面成熟抗原）的双靶点CAR-NK或CAR-T细胞疗法（cCAR）可能为SLE患者提供一种新的治疗选择（Wang et al., 2024）。这种治疗方法通过同时针对B细胞表面的CD19和BCMA，有望消除产生自身抗体的细胞，从而彻底阻止SLE的疾病进程(Zhang et al., 2021)。目前，上市的CAR T疗法用于治疗SLE并取得较好的效果。
CAR-NK治疗方法通过基因工程技术，将特定的嵌合抗原受体（CAR）导入自然杀伤（NK）细胞中，使其能够特异性识别并杀伤表达相应抗原的细胞，如表达CD19的B细胞（图1）。本公司生产的CAR-iNK来源于临床级的iPSC的分化并且通过基因编辑进行了通用化改造，避免了患者免疫系统的清除和杀伤，以最大程度发挥杀伤效果。
Wang W, He S, Zhang W, Zhang H, DeStefano VM, Wada M, Pinz K, Deener G, Shah D, Hagag N, Wang M, Hong M, Zeng R, Lan T, Ma Y, Li F, Liang Y, Guo Z, Zou C, Wang M, Ding L, Ma Y, Yuan Y. BCMA-CD19 compound CAR T cells for systemic lupus erythematosus: a phase 1 open-label clinical trial. Ann Rheum Dis. 2024 May 30:ard-2024-225785. doi: 10.1136/ard-2024-225785. Epub ahead of print. PMID: 38777376
2. 临床需求 Clinical Needs
全球发病率和患病率：全球SLE的发病率估计值为每年5.14/10万人年，新诊断人口为每年约40万人。不同地区的发病率和患病率差异很大，这可能与种族、环境因素和社会经济地位有关。
性别和年龄：SLE主要影响年轻女性，但也可能影响男性、儿童和老年人。女性患病率远高于男性，且在育龄期女性的发病率最高。
地理差异：北美、欧洲和亚洲的发病率和患病率通常高于非洲和南美洲。例如，北美的发病率和流行率最高，而非洲和乌克兰的报告发病率最低。
种族差异：非裔美国人、亚裔美国人、非裔加勒比人及拉丁裔美国人的SLE患病率通常高于白人。
死亡率：SLE患者的死亡率是普通人群的2-3倍，主要死因包括感染和心血管疾病。
根据《2020中国系统性红斑狼疮诊疗指南》，患病人数约100万人，男女患病比为1∶10~12。中国的SLE发病率位居全球第四，为每年8.57/10万人。红斑狼疮（SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，目的治策略主要包括免疫调节剂、免疫抑制剂和免疫疗法，但并不能根治疾病。本产品筛选和优化具有特殊结构和序列靶向BCMA的CAR，同时靶向CD19，构建双CAR分子定点插入iPSC的AAVS1位点，分化成CAR-iNK产品，通过静脉输注的方式治疗SLE。
3. 全球同产品对比情况 Comparison of Similar Products Worldwide
泉生生物对比同类产品的优势：
1、双靶点设计：泉生生物生产的CAR-iNK 采用CD19、BCMA双靶点设计，对比单靶点可更有效的清除产生自身抗体的B细胞和浆细胞。
2、通用型：泉生生物采用本公司自研的通用性型IPSC，可有效避免的宿主抗移植物反应（GVHD），避免患者的免疫系统对CAR-iNK 的清除，可异体输注。
3、现货型：泉生生物生产的CAR-iNK相较于现有CAR-T产品无需采集患者自体的免疫细胞，体外编辑后回输，可以现货直接输注，有效缩短给药实验，节约成本同时更及时治疗患者。
4、安全性：采用CRISPR/Cas9定点敲入基因组的安全位点（safe harbor），相较于慢病毒的随机插入安全性更高。
| 研发机构 | 药品名称 | 临床阶段 | 作用靶点 | 适应症 |
| Century Therapeutics | CAR-NK | 临床1期 | CD19 | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 先博生物 | CAR-NK | 研究者发起的临床试验（IIT） | CD19 | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 南京恩瑞恺诺生物技术有限公司 | CAR-NK（KN5501） | 研究者发起的临床试验（IIT） | CD19 | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 上海泉生生物工程有限公司 | CAR-NK（CD19&BCMA） | 临床前 | CD19、BCMA | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| Cabaletta Bio | CAR-T | 临床1/2期 | CD19 | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 诺华 | CAR-T | 临床1期 | CD19 | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 石药集团 | CAR-T（SYS6020） | 临床1期 | BCMA | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 复星凯特 | CAR-T（FKC288） | 临床1期 | CD19、BCMA | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 亘喜生物 | CAR-T（FasTCAR-T GC012F） | 临床1期 | CD19、BCMA | 系统性红斑狼疮（SLE） |
| 药明巨诺 | CAR-T | 研究者发起的临床试验（IIT） | CD19 | 系统性红斑狼疮（SLE） |
4. 药学数据 CMC Data
我们筛选和优化具有特殊结构和序列靶向BCMA的CAR，同时靶向CD19，构建双CAR分子定点插入iPSC的AAVS1位点，分化成CAR-iNK产品。
在临床级iPSC完成CD19的CAR敲入，并得到了表达CAR分子的单克隆细胞（单克隆细胞制备的工艺流程见图1）；
目前分化得到的CAR-iNK的CD56+纯度在90%以上(CAR-iNK的基因修饰见图2）。
本产品预计2024年年底进入CMC阶段。
5. 非临床数据 Preclinical Data
5.1 CAR-iNK的基因递送（基因编辑IPSC）
5.1.1电转递送工具酶和donor基因
采用CRISPR/Cas9定点敲入AAVS1位点，通过lozan电转仪进行递送
| 地点 | 上海泉生生物工程有限公司 |
| 电转仪 | 龙沙（Lozan）4D-Nucleofector-X Unit |
| 电击次数 | 2次 |
| 体系 | 20μL |
| 程序 | CA137 |
| 细胞量 | 4E5/孔 |
| 递送成分 | 质粒+RNP复合物 |
5.1.2目的基因的鉴定以及富集
通过FACS检测CAR分子的表达情况，电转后3天进行瞬转效率检测，瞬转效率为38.3%（图1），10d进行稳转效率检测，稳定整合效率为2.98%（图2），通过对整合元件进行抗体染色，采用PE-beads（美天旎）将阳性的细胞富集，富集的细胞阳性率可达81.4%（图3）。
5.1.3单克隆细胞获取及鉴定
有限稀释法铺板：消化细胞为单克隆细胞，平均0.8个/细胞每孔进行单克隆铺板，铺板后的细胞放置在37℃ 5% 的CO2培养相中培养约10-14天。
显微镜下挑取长势良好、形态正常的单克隆细胞，用消化细胞，取1/2细胞本分用于基因组鉴定，1/2传代至24孔板，提取单克隆细胞的基因组DNA，以其为模板进行PCR链式反应，将PCR产物送至测序公司测序，测序比对分析确定筛选到的细胞为单克隆，经鉴定共得到了12个单克隆细胞,且单克隆细胞经鉴定CAR+的表达可达到90+（图4）。
位点修复情况 | 克隆数 |
+1 | 4 |
-1 | 3 |
-11 | 2 |
0 | 3 |
5.2 CAR-iNK分化
5.2.1 iPSC干性以及支原体检测
| 细胞 | GMP-iPSC-001 |
| 修饰 | AAVS1 intron1KI-gene |
| 总代次 | < P50 |
| CAR+ | 0.81 |
| 干性 | 5个干性maker比例均在90%以上 （TRA-1-60-R、TRA-1-81、SSEA-4、Nanog、Oct3/4） |
| 支原体 | 阴性 |
基因编辑后pool细胞的干性检测：
基因编辑后单克隆的干性检测：
5.2.2 IPSC的3D培养
传统的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）多用2D方式培养，限制了细胞量和培养基器皿，本公司通过高效的3D培养方式，分化工艺行业内领先。
基因编辑得到的单克隆细胞在3D培养基中适应约2代，即可加入培养瓶中进行悬浮培养，培养至第5天，细胞球直径达到250-300μM后消化传代。
5.2.3 IPSC向HPC分化
3D培养IPSC向HPC分化，将3D培养瓶中的IPSC通过低速离心的方式（50g 2min）离心去弃去3D培养基，更换为HPC分化培养基，通过细胞的不同时期更换成分配比，全程约6-7d，可得到CD34+的HPC细胞，消化细胞球通过FACS方式检测检测CD34+比率。
5.2.4 HPC向NK分化
将HPC分化培养基更换为NK分化培养基，分化早期约6-7天需加入IL-3使HPC朝向NK细胞分化，后期无需添加。分化前0-16天通过静置沉降后弃去上清方式换液，分化16-24天静置沉降后，需将吸出的上清400g 离心5min，得到的NK细胞重新加入培养瓶中。NK分化全程约24-30天，分化结束后的细胞进行表型检测、冻存部分细胞进行扩增。
5.3 CAR-iNK扩增（Feeder法）
5.3.1 feeder细胞的构建
通过慢病毒的方式将4-1BBL、mbIL18、mbIL21递送至K562细胞并加入筛选标记puror通过嘌呤霉素进行筛选富集，通过有限稀释法铺板，平均0.8个/细胞每孔进行单克隆铺板，铺板后的细胞放置在37℃ 5% 的CO2培养相中培养约10-14天后鉴定得到单克隆的细胞株。
5.3.2 feeder靶细胞辐照
将feeder细胞扩增至1E10级别,送至上海康守特技术服务有限公司进行辐照，辐照参数为100Gy，辐照结束后的细胞进行冻存操作1E7/支，置于程序降温盒放入-80℃冰箱中，次日放入液氮中长期保存。
5.3.3 feeder法扩增CAR-NK
通过慢病毒的方式将4-1BBL、mbIL18、mbIL21以及筛选标记puror递送至K562细胞，感染后3天通过嘌呤霉素进行筛选富集；通过有限稀释法铺板，平均0.8个/细胞每孔进行单克隆铺板，铺板后的细胞放置在37℃ 5% 的CO2培养相中培养约10-14天后鉴定得到单克隆的细胞株。
5.4 CAR-iNK的功能测试
5.4.1 CAR-NK细胞的体外功能检测
FACS检测CAR-NK（pool）的NK细胞纯度（CD56）,并检测CAR-NK（pool）CAR+ 的的表达基因修饰策略如图10所示。
采用钙黄绿素法进行细胞毒性实验，可以发现加装CAR-iNK相对于iNK对靶细胞更有效的被杀伤，结果如图所示：
5.4.2 CAR-NK细胞的体内功能检测
模型:NVG-hIL15 小鼠，6-7只/组 ，分为三组，小鼠约20g，给药前2天注射一定剂量的NALM6-Luci细胞进行造模。
细胞：CAR-iNK
实验组：NVG-hIL15 小鼠（低剂量组、高剂量组）
对照组：NVG-hIL15 小鼠（注射iNK）
对照组给药1E6 cells/g;低剂量给药1E6 cells/g; 高剂量给药4xE6 cells/g
给药：2,8,15d，共3次。
检测:最后一次给药后1个月取材检测。
泉生生物，目前有多款产品获得临床批件，并有产品进入临床实验阶段，另有两款iPSC来源产品在CMC或非临床阶段，目前SLE管线正处于临床前药学测试阶段，计划于2025年一季度进入非临床。
6. 生产能力 Production Capacity
7. 临床试验数据 Clinical Data
8. 中美欧药监局双申报计划 Plan for China NMPA, US FDA & European EMA Filings
9. 专利情况 Patent Info
泉生生物已License in国内呈诺医学GMP级iPSC细胞库，同时积极License in日本京都大学临床级iPSC细胞株，努力建立自己的重编程iPSC细胞株；泉生生物已建立完成iPSC基因编辑和iPSC向不同亚型细胞类型诱导分化以及嵌合抗原受体（CAR）序列发现等领先的关键技术平台，重点布局神经损伤或神经退行性及自身免疫性疾病治疗领域，并布局全球技术专利体系，预计2024年申请提交发明专利至少3项。
专利研究证明aCGT的“诱导多能干细胞来源细胞注射液及其临床应用”不存在潜在知识产权纠纷。
参考文献：
Zhang, W., Feng, J., Cinquina, A., Wang, Q., Xu, H., Zhang, Q., Sun, L., Chen, Q., Xu, L., Pinz, K., et al. (2021). Treatment of Systemic Lupus Erythematosus using BCMA-CD19 Compound CAR. Stem Cell Rev Rep 17, 2120-2123.